珈創(chuàng)生物 —— 生物技術服務與研發(fā)為一體的高新技術企業(yè)
優(yōu)質高效透明
High quality, efficient and transparent
中國藥典要求對細胞系進行檢定，NMPA、FDA、EMA、世界衛(wèi)生組織（WHO） 和人類用藥注冊技術要求協(xié)調(diào)國際會議（ICH）的各種法規(guī)文件概述了對細胞庫檢定的要求和指導，以確認細胞的起源和歷史，并鑒定和測試細胞的身份，穩(wěn)定性和純度。
細胞檢定主要包括幾個方面：細胞鑒別、無菌檢查、支原體檢查、內(nèi)外源病毒因子檢查、成瘤性/致瘤性檢查等。
這些檢測項目對于 MCB 細胞和 WCB 細胞及生產(chǎn)限定代次細胞均適用。
我們建議在藥物生產(chǎn)的各個階段對哺乳動物和非哺乳動物細胞系進行檢定，包括：
主細胞庫（MCB） 工作細胞庫（WCB） 生產(chǎn)終末細胞（EOPC） 病毒種子庫（VSS） 原材料及最終產(chǎn)品
細胞系檢測
細胞鑒別試驗
新建細胞系/株、細胞庫和生產(chǎn)終末細胞應進行鑒別試驗，以確定為本細胞，且無其他細胞的交叉污染。珈創(chuàng)生物提供多種鑒別試驗，客戶可選擇一種或多種方法對其細胞系/株進行種屬鑒別。
染色體核型分析
核型分析的結果可以確認樣品的細胞系身份和來源物種。我們擁有多種細胞（包括人源細胞，人源干細胞，猴 Vero，倉鼠 CHO）核型細胞分析的豐富經(jīng)驗。
染色體核型分析包括但不限于：中期染色體 G 顯帶分析和染色體計數(shù)（提供二倍體染色體數(shù)，頻率分布和多倍體水平）。
同工酶試驗
對細胞乳酸脫氫酶（LD）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）和核苷磷酸化酶 （NP）三種酶分別進行凝膠電泳試驗，并通過與指示細胞對比，確定有無交叉污染。
短串聯(lián)重復序列分析(STR)
STR（短串聯(lián)重復序列）分析法即通過提取樣品 DNA，PCR 擴增 STR 位點， PCR 產(chǎn)物檢測，檢測結果分析，并與 ATCC 和 DSMZ 數(shù)據(jù)庫進行比對，以確定樣品種屬來源，判斷其是否存在其他人源細胞交叉污染。
無菌檢查
參考中國藥典通則 1101，提供符合法規(guī)要求的薄膜過濾法和直接接種法。無菌檢查均在 A 級隔離器或 C+A 級環(huán)境中進行，且在檢測過程中持續(xù)進行環(huán)境監(jiān)測。
適用性檢查：均可按照法規(guī)的要求，對不同的供試品進行適用性試驗。 以確認所采用的方法適合供試品的無菌檢查。
薄膜過濾法：采用封閉式薄膜過濾器，可過濾大量供試品以及利于解決供試品中可能存在微生物生長抑制劑等問題。是可過濾供試品首選的檢測方法。
直接接種法：適用于無法用薄膜過濾法進行檢測的供試品，包括混懸液等非澄清水溶液、固體供試品、非水溶性供試品和滅菌醫(yī)療器械等。
分枝桿菌檢查
珈創(chuàng)生物參考中國藥典通則 1101，采用 Middlebrook 7H10 平板培養(yǎng)法，提供符合法規(guī)要求的分枝桿菌檢查。檢查均在A級隔離器或C+A級環(huán)境中進行，且在檢測過程中持續(xù)進行環(huán)境監(jiān)測。
支原體檢查
珈創(chuàng)生物參考中國藥典通則 3301，提供符合法規(guī)要求的支原體檢查包括培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA 染色法）。
培養(yǎng)法：供試品分別接種固體和液體培養(yǎng)基，于接種一周后取液體培養(yǎng)基轉種進行次代培養(yǎng)，觀察初代培養(yǎng)和次代培養(yǎng)結果。
指示細胞培養(yǎng)法（DNA 染色法）：供試品接種于對照細胞，培養(yǎng) 3-5 天后傳代再培養(yǎng) 3-5 天，于培養(yǎng)期末進行染色觀察。
內(nèi)外源病毒污染檢查
檢查細胞系/株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于使用的原 材料或操作帶入的外源性病毒。細胞進行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細胞種屬來源、組織來源、細胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)方法及過程等確定。 在您開展檢測前，珈創(chuàng)愿意與您進行充分的溝通，確定合適的檢測方案。
細胞形態(tài)觀察及血吸附試驗
體外不同指示細胞接種培養(yǎng)法
動物體內(nèi)接種法
乳鼠腦內(nèi)及腹腔接種法
小鼠腦內(nèi)及腹腔接種法
豚鼠腹腔接種法
家兔皮內(nèi)及皮下接種法
雞胚接種法
雞胚卵黃囊接種法
雞胚尿囊腔接種及尿囊液血凝試驗
逆轉錄病毒檢測
逆轉錄酶活性測定法 PERT
感染性試驗
透射電鏡觀察法
種屬特異性外源病毒因子檢測
應根據(jù)細胞系/株種屬來源、組織來源及供體健康狀況等確定檢測病毒的種類。
鼠源細胞系
鼠源病毒檢查
人源細胞系/株
人源病毒檢測Q-PCR法
牛源性病毒檢測
細胞培養(yǎng)法
熒光抗體檢測法
豬源性病毒檢測
細胞培養(yǎng)法
普通PCR法
Q-PCR法
其他特定病毒檢測
鼠細小病毒檢測
細胞培養(yǎng)法
普通PCR法
Q-PCR法
杯狀病毒（Vesivirus 2117）檢測--Q- PCR法 CHO細胞系
成瘤性檢查
動物體內(nèi)接種法（裸鼠）
軟瓊脂克隆形成試驗
干細胞等不同類別細胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)過程都會涉及細胞的離體培養(yǎng)。而細胞離體培養(yǎng)必然會涉及生物學屬性的變化、生物學安全性改變、外源性污染、交叉污染等問題，這些問題嚴重影響研發(fā)初始到生產(chǎn)過程的進展和成功。干細胞產(chǎn)品的多樣性、復雜性對于其質量控制提出巨大的挑戰(zhàn)。
干細胞的綜合質量要求可歸納為基本生物學屬性，微生物學安全性，生物學安全性及生物學有效性四大類，珈創(chuàng)生物期待與您進行充分的溝通，確定合適的干細胞質量控制方案。
基本生物學屬性
細胞鑒別：
染色體核型分析
同工酶試驗
短串聯(lián)重復序列分析(STR)
細胞活性鑒別：
細胞計數(shù)和細胞存活率檢測
細胞生長曲線測定
細胞周期測定--PI 染色法
微生物安全性評價
微生物安全性方面，包括各類干細胞在內(nèi)的所有治療性細胞產(chǎn)品需具備生產(chǎn)用細胞基質的微生物安全性。需要對相關細胞進行無菌，支原體，分枝桿菌，內(nèi)外源特異或非特異性病毒，內(nèi)毒素微生物代謝產(chǎn)物的檢測。另外，在干細胞的獲取，擴增，培養(yǎng)傳代和凍存過程中，應對所使用材料相關的可能的動物源性微生物污染進行檢測。
生物安全性評價
干細胞的生物學安全性主要由其細胞生物學特性，細胞來源，制備工藝等相關風險因素決定，各種風險因素可導致細胞產(chǎn)品的異常免疫反應，致瘤性和/或促瘤性等，目前干細胞生物安全性評價以免疫學反應和致瘤性為主要內(nèi)容。
成瘤性檢查
端粒酶活性檢查
免疫學反應檢測
淋巴細胞增殖抑制試驗
特定淋巴細胞亞群檢測法（Th1,Th17,Treg）
淋巴細胞分泌 TNF-α抑制試驗
生物學有效性檢查
珈創(chuàng)生物對于 MSC 的生物學有效性可開展相應的檢測服務。
生物學有效性評價
成骨細胞分化試驗
成軟骨細胞分化試驗
成脂細胞分化試驗
珈創(chuàng)生物在生物制品的質量控制領域不停探索，為您提供可靠的檢測服務，新的檢測服務持續(xù)開發(fā)中。
病毒種子批質量檢測服務
生物制品生產(chǎn)用菌毒種應采用種子批系統(tǒng)，應進行生物學特性，生化特性等檢測，珈創(chuàng)生物結合中國藥典規(guī)定，為客戶提供一定程度的病毒種子批和菌種檢測服務。
病毒種子批檢測服務
無菌檢查
支原體檢查
分枝桿菌檢查
外源病毒因子檢查
病毒滴度測定
菌種檢測服務
原核或真核系統(tǒng)表達、生產(chǎn)生物制品，應對其重組菌（細菌、酵母菌）進行相應的鑒定和質量檢測，符合相關規(guī)定方可使用。
菌種檢測服務
菌株染色觀察
普通染色
革蘭氏染色
菌落形態(tài)觀察
菌株抗生素抗性試驗
菌株生化特征分析--生化反應試驗
菌種檢查--核酸序列測序分析
噬菌體污染檢查
透射電鏡觀察--負染色法析
培養(yǎng)觀察--噬斑法
原材料檢測服務
對于不同風險級別原材料的質量控制，應充分考慮來源于動物（或人）的生物原材料可能帶來的外源因子污染的安全風險。
根據(jù)原材料的來源、生產(chǎn)以及對生物制品潛在的毒性和外源因子污染風險等將生物制品生產(chǎn)用原材料按風險等級別劃分，對于不同風險級別原材料，應充分考慮可能帶來的外源因子污染的安全性風險進行檢測。
珈創(chuàng)生物能夠針對性的對生產(chǎn)過程中所用的原料進行檢定，通過無菌，支原體，病毒外源因子，內(nèi)毒素等檢測，來證明生產(chǎn)過程的細胞培養(yǎng)成分，添加物和胰酶等的質量。基因治療藥物生產(chǎn)過程中的質粒 DNA 也可進行相應的檢定。
無菌檢查
支原體檢查
外源因子檢測
動物來源原材料牛源病毒測試
動物來源原材料豬源病毒測試
動物來源原材料鼠源病毒測試
內(nèi)毒素檢測
無論是原核或真核系統(tǒng)表達、生產(chǎn)生物制品，都存在不同程度的殘留物于產(chǎn)品中，因此，殘留物的檢測是必需的，否則嚴重影響產(chǎn)品質量。
如：牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)是胎牛血清中的主要成分，廣泛應用在抗體藥物、疫苗藥物以及CGT藥物等生物制品的生產(chǎn)過程中。對于疫苗類藥物，目前很多病毒性疫苗產(chǎn)品（如狂犬、麻疹、腮腺炎、風疹、水痘疫苗等）是采用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的，因此牛血清白蛋白(BSA)殘留量的檢測是疫苗產(chǎn)品中重要的質控指標，直接關系到疫苗使用的安全性。
如：抗生素殘留對人體健康有著十分嚴重的危害，包括“三致”（致癌、致畸、致突變）作用、人體對此類藥物的長期暴露，通常不會造成急性中毒，而主要是引起慢性中毒。
抗生素不是疫苗中的必須成分，但在一些疫苗的制備過程中，為了防止細菌污染，所以要添加一些抗生素。在最終成品前，還要盡量去除抗生素。
《中國藥典 2020版 三部》中各種疫苗藥物的BSA的殘留量都進行了明確規(guī)定：原液應不高于50ng/ml（除甲型肝炎滅活疫苗），成品應不高于50ng/劑。
我司參照以上法規(guī)要求，搭建了相應的殘留物檢測技術體系，具體項目如以下表格：
表 1 原材料檢定項目匯總表
| 序號 |
類別(產(chǎn)品/項目/參數(shù)) |
產(chǎn)品/項目/參數(shù) |
參考法規(guī)
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| 序號 | 名稱 | |||
| 1 |
殘留物檢測 |
1.1 |
牛血清白蛋白殘留檢測法 |
《中國藥典 2020版 三部》各論、通則3407 /3408/ 3411 |
| 1.2 |
抗生素殘留檢測--培養(yǎng)法 （含青霉素、鏈霉素） |
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1.3 |
CHO細胞DNA殘留檢測法 |
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在慢病毒載體的生產(chǎn)過程中，因穿梭載體、包裝載體及包裝細胞中的內(nèi)源性逆轉錄元件之間，或病毒載體與細胞的內(nèi)源性逆轉錄元件之間發(fā)生重組可能產(chǎn)生具有復制能力的慢病毒，即復制型慢病毒（replication competent lentivirus, RCL）。鑒于RCL潛在的威脅，F(xiàn)DA及歐盟先后出臺了相關文件，要求在在生產(chǎn)及應用的不同階段進行RCR/RCL的控制，包括生產(chǎn)病毒的細胞庫、終末細胞、病毒載體及轉導細胞，并對CAR-T細胞回輸后的患者個體進行監(jiān)測。
敏感細胞共培養(yǎng)測定法
將可能存在RCL風險的樣品在敏感細胞上擴增，并在指示終點利用敏感、快速的檢測方法（ELISA p24蛋白測定法、Q-PCR法、產(chǎn)物增強性逆轉錄酶活性檢測法（PERT））進行檢測。
構建HIV-1弱毒株作為RCL實驗的陽性對照病毒，設置陰性對照、陽性對照和抑制對照，驗證反應體系的適用性，監(jiān)測反應靈敏度。
RCL檢測方法已經(jīng)過方法驗證，可滿足不同類型供試品的檢測需求。
主要法規(guī)依據(jù)
《CAR-T細胞治療產(chǎn)品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》，中國食品藥品檢定研究院，2018
《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2022
《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2022
Guidance for Industry: Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up ，F(xiàn)DA，2020
Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) ，F(xiàn)DA，2020
EUROPEAN PHARMACOPOEIA 10.0
珈創(chuàng)生物在生物制品的質量控制領域不停探索，為您提供可靠的檢測服務，新的檢測服務持續(xù)開發(fā)中。
